本网讯近日，江西理工大学化学化工学院（功能晶态材料化学江西省重点实验室）张家林课题组的研究论文“Ultrasensitive COFs Functionalized Electrochemical Biosensor for DNA Methyltransferase Activity Detection by DNA Walking and Rolled Circular Strand Displacement Amplification”在分析化学领域权威期刊《Analytical Chemistry》(SCI一区Top期刊，影响因子6.8)公开发表，学生第一作者为2023级硕士研究生毛碧瑶，通讯作者为江西理工大学张家林博士和中南林业科技大学任佳丽教授。
DNA甲基化作为生物体中一种重要的表观遗传修饰，在基因表达调控、细胞功能调节和疾病发生过程中具有重要的生物学意义。DNA甲基化转移酶（DNA MTases）是负责向DNA分子添加甲基的酶，这一过程会在特定的碱基上形成甲基化修饰，从而改变DNA的结构和功能，进而调控基因的表达。原核生物中的DNA甲基化系统在调节细菌的毒力、抗生素耐药性以及基因组修复等方面发挥着重要作用。因此，开发高灵敏度的传感器以评估DNA甲基化转移酶活性、筛选相关抑制剂，对于探索DNA甲基化的生物学机制、开发新的疾病治疗手段及抗生素耐药性干预策略等方面具有重要意义。
近年来电化学策略因其设备成本低、操作简便、易于分析等优势，在DNA甲基化分析领域获得了广泛关注。在此背景下，受滚环扩增(RCA)技术启发，滚环扩增链位移(RC-SDA)技术被开发并广泛关注，该方法能够有效促进滚环链置换扩增。此外，DNA行走技术显著提高了检测灵敏度。RC-SDA反应与DNA行走技术的结合，为DNA甲基化转移酶的活性检测开辟了新的可能性。这一组合不仅简化了检测流程，而且显著提高了检测效率，为DNA甲基化研究和相关疾病的诊断提供了更加高效和敏感的技术手段。
COFs以其独特的多孔性、优越的电子性能和机械性能而著称，广泛应用于各种领域。特别是在电化学生物传感器的开发中，COFs与其他电活性材料结合使用，显著提升了传感器的分析性能。这些材料的高度可调结构使其在提高传感器灵敏度、选择性以及稳定性方面发挥了重要作用。
基于此，张家林课题组开发了一种新的COFs功能化电化学生物传感器，利用DNA助步器和RC-SDA反应，实现DNA腺嘌呤甲基化(Dam) MTase活性的高灵敏和快速检测。具体来说，发夹探针H1被Dam-MPase甲基化，DpnI酶特异性切割甲基化位点产生S5探针。引入具有两个核酸内切酶位点的挂锁探针，在引物的作用下引发RC-SDA反应，释放出大量单链S6探针。释放的探针与Exo III酶协同作用，触发DNA行走，暴露出结合位点，使Au-COF-MB信号探针能够有效地结合到电极表面，从而产生电化学信号。结果表明，所设计的电化学生物传感器在检测Dam-MPase活性方面表现出优异的灵敏度和特异性，检测限(LOD)为6.85×10-5U/mL。构建策略如图1所示。
图1.基于DNA walker和RC-SDA的COF功能化电化学生物传感器用于检测DNA甲基转移酶活性的构建示意图。
通过傅里叶变换红外光谱、XPS以及紫外可见吸收光谱对COFs功能化复合材料的材料表征，验证了信号探针的成功合成（图2）。此外，还通过对材料的电化学性能表征，验证了COF-Au作为信号载体的优越性。
图2.(A)TAPB、DMTP、COF和COF-Au的傅里叶变换红外光谱；(B)COF和COF-Au的XRD图谱；(C)COF和COF-Au的XPS测量光谱；(D)COF、COF-Au、COF-Au-MB和MB在220-800 nm范围内的紫外可见光谱。
通过对电极上传感过程的表征包括循环伏安法、电化学阻抗、琼脂糖凝胶电泳以及差分脉冲伏安法验证了该传感策略的可行性（图3）。这些结果表明，只有当甲基化转移酶存在的情况下，才能触发RC-SDA以及DNA Walker反应，从而检测出电化学信号。
图3.(A)CV和(B)EIS测试电化学生物传感平台逐步制备过程；(C)琼脂糖凝胶电泳传感过程的研究；（D）传感器在1 mL PBS缓冲液（0.05 M，pH 7.4）中有和没有Dam MTase时的DPV响应。Dam-MPase浓度为10U/mL。
为评价该方法在筛选Dam MTase抑制剂方面的潜在应用，对5-氟尿嘧啶的抑制作用进行了检测。将不同浓度的5-氟尿嘧啶逐渐加入DNA甲基化反应液中，并记录电流值的变化。通过计算，抑制50%酶活性所需的IC50为2.6μM，其定义为将酶活性降低50%所需的抑制剂浓度。为评价传感器在实际样品测定中检测Dam MTase活性的实用性。在制备的10%正常人血清和唾液样品中添加浓度为8.0×10-4~8.0 U/mL的Dam MTase。结果所明，计算的回收率为95.8~105.5%，RSD范围为3.89% ~6.55%。说明该传感器适用于复杂样品的分析。
据悉，本研究得到了国家自然科学基金、江西省自然科学基金、湖南省科技创新平台计划项目、研究生创新专项项目和克州科技项目的资助。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c06572
文、图/张家林
一审/黄海平
二审/陈琰
三审/夏李斌、刘遂军
